浅谈细胞内蛋白的靶向降解
发布日期：2023-03-22 浏览次数：2164
人体包含数以亿计的蛋白分子，大多数蛋白必须折叠成精确的三维构象才能发挥生物学功能[1]。然而，突变、应激反应、代谢紊乱等因素，使得蛋白质在细胞的生命过程中时常发生错误折叠，进一步的聚集则会诱发多种疾病。因此，真核细胞必须与层出不穷的受损或错误折叠蛋白作斗争，以维持细胞内蛋白稳态平衡及细胞活力[2]。在调控机体蛋白质平衡的网络中，核糖体和分子伴侣能够促进蛋白质的生成和正确折叠，泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）和自噬-溶酶体途径（autophagy-lysosome pathway，ALP）则主要负责胞内异常蛋白的降解与清除。近来兴起的靶向蛋白降解（targeted protein degradation，TPD）技术通过调动细胞内天然的两大蛋白降解机制（UPS或ALP）下调致病靶蛋白，有望克服传统药物研发技术的瓶颈问题，挑战“难成药”靶点，为分子靶向治疗领域提供新的化学工具和药物发现策略。
01 基于泛素-蛋白酶体系统（UPS）的靶向蛋白降解
UPS 由泛素（ubiquitin，Ub）、泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）、泛素连接酶（ubiquitin ligase，E3）、蛋白酶体和胞内蛋白底物组成，是细胞内80%以上蛋白质降解的主要途径[3]。UPS降解蛋白的过程如下（图1）：
首先，E1通过ATP依赖的反应与泛素形成硫酯键，激活泛素；随后，活化的泛素通过硫酯交换反应转移到E2上，释放E1，形成“E2-泛素复合物”；该复合物进一步招募E3、识别并结合底物蛋白，驱动目标蛋白赖氨酸残基（Lys或K）的ε-NH2与一个泛素分子形成酰胺键，接着该泛素分子在K48位与下一个泛素分子的C端连接，发生多泛素化；最后，多泛素化的底物蛋白被26S蛋白酶体识别，经各种酶水解成寡肽，并最终从蛋白酶体中释放[4, 5]。
基于UPS的靶向蛋白降解技术主要包括蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis targeting chimaera，PROTAC）[6]、分子胶（molecular glue）[7]和疏水标签（hydrophobic tag，HyT）[8]等。其中研究最为成熟的是PROTAC技术，目前已有ARV-110、ARV-471、KT-474和DT2216等多个PROTAC分子进入临床试验阶段。
图1 基于UPS或ALP的靶向蛋白降解机制
（图片由 BioRender.com创建）
图2 代表性的细胞内靶向蛋白降解技术
（图片由 BioRender.com创建）
小分子疏水标签由大的疏水基团（例如金刚烷Adamantane或Boc3Arg）和靶蛋白配体连接而成（图2）。蛋白质折叠的主要驱动力是隐藏在蛋白质内部的疏水残基，相应地，这些疏水区域的暴露被认为是蛋白未正确折叠的标志[8]。靶蛋白与小分子疏水标签的结合将增加靶蛋白表面的疏水性，模拟部分未折叠蛋白的状态，从而被热休克蛋白Hsp70和Hsp90等分子伴侣进一步识别和招募，最终被蛋白酶体降解。
02 基于自噬-溶酶体途径（ALP）的靶向蛋白降解
溶酶体是真核细胞内除UPS之外的另一个重要的蛋白降解系统，也逐渐应用到了靶向蛋白降解领域。基于溶酶体途径的靶向降解技术主要包括内体-溶酶体途径（endosome-lysosome pathway，ELP）和自噬-溶酶体途径（autophagy-lysosomal pathway，ALP）。其中，基于ALP的靶向蛋白降解技术进一步拓展了细胞内靶蛋白的范围，主要包括：自噬体绑定化合物（autophagosome-tethering compound，ATTEC）[10-12]、自噬靶向嵌合体（autophagy-targeting chimera）AUTAC[13]和AUTOTAC[14]等。
人们通常所说的“自噬”主要是指“巨自噬”。自噬降解蛋白的大致过程如下：
首先，在细胞自噬诱导信号的调控下，微管相关蛋白1A/1B轻链3（microtubule-associated protein 1A/1B 1ight chain 3，LC3）由胞浆型LC3（LC3-Ⅰ）脂化成自噬体膜型LC3（LC3-Ⅱ），吸附在由高尔基体、内质网等细胞器的游离膜形成的杯状双层膜结构的吞噬泡（phagophore）上，并进一步延伸；吞噬泡进一步包裹住胞质中的靶蛋白等底物形成双层膜结构的封闭隔室，即自噬体（autophagosome）；最后，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome）完成后续降解（图1）。
ATTEC最初是指一类能将突变亨廷顿（mutant huntingtin，mHTT）蛋白和LC3蛋白绑定在一起的分子胶，能够驱动mHTT基于ALP途径降解。后来，研究人员仿照PROTAC的设计策略，将这些ATTEC小分子作为LC3结合配体与不同的靶蛋白配体通过连接子连接，得到了一类异双功能的自噬降解剂（图2），进一步扩充了ATTEC的含义，并成功用于降解BRD4、NAMPT等蛋白[10] [12]。
AUTAC也是一类异双功能分子，包含靶蛋白配体、降解标签（cGMP类似物）和连接子三个部分（图2）[13]。在细胞内，AUTAC首先与靶蛋白结合，通过降解标签模拟“S-鸟苷化修饰”（S-guanylation）并诱导靶蛋白的K63多聚泛素化，泛素化的靶蛋白随后被自噬受体p62选择性识别并结合，p62进一步与LC3相互作用，介导靶蛋白被募集到自噬体中，最后与溶酶体融合完成降解。但是S-鸟苷化修饰如何诱导K63泛素化尚不清楚。研究人员已经利用该技术成功降解了MetAP2、FKBP12 等蛋白。此外，AUTAC还适用于线粒体碎片等细胞器的靶向降解。
AUTOTAC可直接与靶蛋白和p62的ZZ结合域结合形成三元复合物，进而介导靶蛋白的ALP降解（图2）[14]。该过程无需靶蛋白的泛素化反应过程，而是直接以p62依赖的方式启动了巨自噬诱导级联反应。研究表明，AUTOTAC不仅可以介导单体蛋白的靶向降解，还可以介导蛋白聚集体的降解，例如神经退行性疾病的病理聚集物——tau蛋白（P301L突变），为神经退行性疾病的病理聚集物的清除提供了新的技术手段和治疗策略。
总结
综上所述，细胞内靶向蛋白降解技术利用真核细胞内固有的两大蛋白降解系统——泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬-溶酶体途径（ALP），实现胞内蛋白的靶向降解，正引领着下一代小分子药物的发展方向。目前已经有PROTAC分子或分子胶在临床试验中取得了积极的结果，但大部分的靶向蛋白降解技术尚处于研究的早期阶段，还面临着许多挑战。我们需要突破的方向在于持续优化现有降解技术，挑战更多难以靶向的“难成药”靶点，提高成药性并实现临床转化。
参考文献
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[13] Takahashi, D.; Moriyama, J.; Nakamura, T., et al. AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. Molecular cell. 2019, 76, 797-810.e710.
[14] Ji, C. H.; Kim, H. Y.; Lee, M. J., et al. The AUTOTAC chemical biology platform for targeted protein degradation via the autophagy-lysosome system. Nature communications. 2022, 13, 904.
作者简介
王 蔚，海军军医大学药学院
盛春泉，海军军医大学药学院
